In Splinter Cell: Blacklist ist einer Gruppe von Schurkenstaaten die militärische Präsenz der USA in ihren Ländern ein Dorn im Auge. Sie stellen der USA ein Ultimatum in Form einer "Blacklist", einem tödlichen Countdown von stetig intensiveren Terroranschlägen, die sich gegen die Interessen der USA richten.
Durch das direkte Mandat des Präsidenten befugt, sich auch außerhalb der geltenden Gesetze zu bewegen, schlüpft der Spieler in die Rolle von Sam Fisher. Ausgestattet mit taktischem Anzug und Spezialsichtbrille, muss er nun die Terroristenzelle infiltrieren und wird dabei erneut seine rücksichtslosen Verhörmethoden einsetzen, um an jene Informationen zu gelangen, die den nächsten Blacklist-Anschlag verhindern könnten.
Im Spielverlauf agieren Sam Fisher und 4th Echelon von einer mobilen Operationseinheit aus, die mit unbegrenzten Ressourcen und der neuesten Technologie ausgestattet ist und an Bord eines umfunktionierten Tarnkappenflugzeuges operiert. Dank des Strategischen Missions-Interfaces (SMI) verfügen Sam und sein Team stets in Echtzeit über die neuesten Erkenntnisse zu allen globalen Ereignissen und sind unmittelbar einsatzbereit.